ADSORÇÃO DA FOSFATASE ALCALINA EM MONOCAMADAS LÍQUIDAS DE FOSFOLIPÍDIOS

Luciano Caseli (PG), Rosa dos Prazeres Melo Furriel (PQ),

Francisco de Assis Leone(PQ), Maria Elisabete Darbello Zaniquelli (PQ)

Departamento de Química – Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto – USP – Ribeirão Preto, SP

palavras-chave: monocamadas líquidas, potencial superficial, fosfatase alcalina

Monocamadas líquidas consistem de sistemas espalhados sob a forma de película, de espessura monomolecular, normalmente sobre soluções aquosas. Suas moléculas constituintes, por apresentarem uma parte apolar e outra polar voltadas respectivamente para o ar e para a água, são chamadas de anfifílicas. Monocamadas de fosfolipídios com proteínas inseridas a partir da subfase aquosa servem como modelo para membranas biológicas.

A fosfatase alcalina é uma enzima responsável pela ação catalítica na hidrólise de ésteres fosfóricos. Ela é uma enzima extrínsica de membrana ligada a ela por uma âncora hidrofóbica de fosfatidil inusitol. Existe uma provável atuação sua no processo de biomineralização com um mecanismo ainda desconhecido, podendo agir isoladamente ou por um complexo multienzimático.

Este trabalho teve como objetivo estudar a interação da fosfatase alcalina em monocamadas dos fosfolipídios DMPA (ácido dimiristoilfosfatídico) e DMPE (dimiristoiletanoamina) através de curvas de pressão e potencial superficiais. Para isso, foram preparadas soluções de DMPA e DMPE (ambos -Sigma) em clorofórmio (Carlo Erba-HLPC) e metanol (Merck) na proporção respectiva de 3:1. Elas foram espalhadas sobre soluções aquosas, contendo ou não a fosfatase alcalina solubilizada, contidas numa cuba de Langmuir (Oficina de Precisão - "Campus" de Ribeirão Preto da USP). A pressão superficial foi monitorada por uma microbalança (Cahn mod. C-32) com o método da placa de Wilhelmy. Para as medidas de potencial superficial foi utilizado o método do eletrodo ratidoativo de amerício (Amersham - Reino Unido) associado a um eletrodo de referência de calomelano saturado (Analion) e um eletrômetro (Keithley) com todo o sistema confinado em uma gaiola de Faraday e o sistema aterrado.

A fosfatase alcalina utilizada foi obtida e purificada conforme descrito em [1]. Assim, duas formas da enzima podem ser obtidas, uma solúvel sem a âncora hidrofóbica e outra com a âncora, cuja solubilização é obtida através de adição de 0,01% de polidocanol (éter de 9-lauril polioxietileno). Esta segunda forma é que foi utilizada neste trabalho.

As isotermas superficiais mostram que há um aumento progressivo nos valores de pressão e potencial superficiais quando se comprime a superfície de uma solução de fosfatase alcalina solubilizada livre de fosfolipídios, mostrando uma adsorção relativa do complexo enzima-polidocanol à interface.

As isotermas superficiais abaixo mostram a influência da fosfatase alcalina na compressão de monocamadas de DMPA e DMPE (Figura 1):

Figura 1: Isotermas para monocamadas de DMPA e DMPE a 23±1^oC.

As curvas de pressão superficial mostram-nos uma extinção da transição de fase líquido-expandido para líquido-condensado do DMPA na presença da enzima. Para o DMPE a transição de fases não é extinta, com a pressão de transição elevada de 11 para 16 mN/m. Os valores de potencial superficial na compressão máxima estão listados na Tabela 1:

Tabela 1: Dados de DV_máx(mV) para monocamadas de DMPA e DMPE

___________________________________________________________________ _subfase\^monocamada DMPE DMPA

___________________________________________________________________

água 350 300

fosfatase alcalina (2,5ng/mL) 200 180

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Os íons Ca²⁺, Zn²⁺ e Tb³⁺ extingüem a transição de fases de líquido-expandido para condensado para monocamadas de DMPA. Íons Na⁺ provocam aumento na pressão de transição. Tais alterações são devido ao tipo de interação desses íons com a cabeça polar do tensoativo. Em contrapartida, a presença de íons na subfase praticamente não altera as isotermas de DMPE. Equanto que o efeito dos íons Zn²⁺ e Tb³⁺ é praticamente o mesmo na presença da proteína. Ca²⁺, conhecido como ativador da enzima [1] provoca efeitos mais pronunciados.

[1]Leone, F.A.; Pizauro, J.M.; Ciancaglini, P.; Trends in Comparative Biochem. & Physiol. 1997,3, 57.

Agradecimentos: FAPESP; CNPq/PADCT