IDENTIFICAÇÃO E ESTUDO DE FRAGMENTAÇÃO DA MICOTOXINA BEAUVERICINA PRODUZIDA POR LINHAGENS DE Beauveria bassiana CULTIVADAS EM MILHO
Grace Kelli Pereira (PG)1, Edson Rodrigues Filho (PQ*)1; Sérgio Batista Alves (PQ)2, Daniel Soza Gomez (PQ)3
1Depto. de Química, Universidade Federal de São Carlos, 2ESALQ-USP-Piracicaba 3Universidade Estadual de Londrina.* edson@dq.ufscar.br; grace@dq.ufscar.br
Palavras-chave: BEA, Beauveria bassiana, espectrometria de massas, APCI-MS/MS.
1. Introdução:
Beuavericina (BEA, 1) é um ciclodepspeptídeo formado por resíduos de N-metil-L-fenilalanina e D-a-hidroxi-isovaleril. Esta micotoxina foi reportada pela primeira vez em cepas de Beauveria bassiana, em 1969 [1] e por volta dos anos 90, ela foi detectada em safras de milho infectadas por espécies de Fusarium em países como Itália, Africa do Sul, entre outros [2,3]. Sua toxicidade foi comprovada para insetos e células humanas, daí a necessidade de desenvolvimento de metodologias de análise visando a identificação e quantificação desta substância, o que foi feito utilizando-se principalmente HPLC com detecção UV [2].
Com o desenvolvimento da espectrometria de massas, principalmente das técnicas de ionização ESI, ApCI e analisadores de massas tandem (MS/MS), vem crescendo cada vez mais o número de aplicações em análises de alimentos e fármacos, pois estas técnicas apresentam alta sensibilidade e quando acopladas a cromatografia líquida de alta resolução (HPLC), formam uma grande ferramenta de análise.
2. Objetivos:
Identificação e estudo de mecanismos de fragmentação da micotoxina BEA produzida por cepas de B. Bassiana isoladas de formigas e besouros e cultivadas em milho, utilizando-se HPLC-ApCI-MS/MS nos modos de ionização positivo e negativo.
3. Materiais e Métodos:
As cepas de B. bassiana foram cedidas pelo Departamento de Entomologia da ESALQ de Piracicaba e Universidade Estadual de Londrina . O cultivo dos fungos foi feito em milho branco ("canjica") esterilizado a 120 oC. Após 30 dias de crescimento, o material foi seco (45 oC), moído e submetido a extração com MeOH - NaCL 1% aq (55:45). O filtrado foi particionado com CH2Cl2, evaporado à vácuo, ressuspendido em 1 mL de CHCl3 que foi aplicado em um cartucho de SPE (LC-Si) previamente condicionado com CHCl3. BEA foi identificada na fração da SPE eluída com CHCl3/MeOH 2% utilizando-se HPLC-ApCI-MSMS nos modos de ionização positivo e negativo.
4. Resultados e Discussões:
Existe na literatura somente um estudo de identificação de BEA por HPLC-ESI-MS/MS [3], onde o enfoque principal do trabalho foi a identificação desta micotoxina em milho contaminado por Fusarium subglutinans eliminando-se etapas na preparação da amostra e consequentemente o tempo de análise. Somente alguns aspectos de fragmentação foram relatados.
Em nosso trabalho utilizou-se a técnica de ionização ApCI que é mais sensível que ESI e acomoda um fluxo maior, de até 1 mL/min, sendo então mais viável ao acoplamento com HPLC. A faixa de detecção utilizada no modo full scan foi de m/z = 450 a m/z = 950 onde pode-se detectar a BEA (MM= 783 Da) e dois outros peptídeos cujas massas molares são MM=515 e 909. Os espectros de massas para as três substâncias no modo ApCI+ mostraram a presença dos íons [M+H]+ = 784, 516 e 910 respectivamente, além da presença de adutos de sódio [M+23]+ e de potássio [M+39]+ onde a intensidade destes adutos, especialmente os de sódio foram muito maiores do que as do pico do íon pseudo-molecular. Já no modo ApCI- não foram observados adutos de nenhuma natureza e os picos [M-H]- = 782, 514 e 908 apresentaram maior intensidade.
Os experimentos de MS/MS realizados no modo de ionização positivo apresentaram uma sensibilidade bastante baixa para detecção de [M+H]+ e alta para os adutos de sódio, que são dificilmente fragmentados mesmo utilizando-se altas energias de colisão (CID). Assim, o estudo de fragmentação no modo positivo pôde ser feito somente através de inserção direta da amostra, sem passar pela coluna. Já o modo de ionização negativo apresentou uma sensibilidade bastante maior, permitindo-se inclusive a análise de íons filhos das três substâncias (MM = 783, 515 e 909) em uma única análise. A energia de colisão foi variada de 15 a 25 eV tanto no modo positivo quanto negativo, e os mecanismos de fragmentação foram propostos a partir destes espectros.
5. Bibliografia:
1. Hamill, R.L ; Higgens, C.E.; Boaz, H.E. - Tetrahedron Lett., 49 (1969) 4255.
2. Morreti, A.; Logriego, A.; Bottalico, A. - Mycol. Res., 99(3) (1993) 285 – 286.
3. Sewram, V.; Nieuwoudt, T – Journal of Chromatography A., 858 (1999) 175 – 185.
CNPq/FAPESP/FINEP