ESTUDOS SOBRE O METABOLISMO DEGRADATIVO DO fenol

e SEUS CLORODERIVADOS em raízes GENETICAMENTE transformadas de CENOURA

Brancilene Santos de Araujo (PG), Barry Victor Charlwood (PQ) e

Marcia Pletsch (PQ)

Departamento de Química, Centro de Ciências Exatas e Naturais

Universidade Federal de Alagoas, Cidade Universitária, 57072-970, Maceió-AL

palavras-chave: cenoura, peroxidases, fenóis

O fenol e seus cloroderivados são poluentes tóxicos, encontrados em esgotos industriais e na formulação de inseticidas, herbicidas e fungicidas, que possuem atividade carcinogênida, teratogênica e mutagênica sobre os seres humanos. Dentre os métodos químicos de descontaminação incluem-se a extração com solvente, a adsorção em carvão ativado e a oxidação química, os quais são muito eficientes, mas dispendiosos, além de gerarem subprodutos tóxicos. O uso de enzimas oxidorredutoras livres ou imobilizadas (peroxidases, lacases e tirosinases) foi proposto como alternativa, porém produtos tóxicos, como furanos e dioxinas, foram também identificados, limitando a aplicabilidade deste método. O uso de peroxidases associadas aos tecidos vegetais foi proposto posteriormente, principalmente as peroxidases de rabanete branco. As peroxidases catalisam a polimerização dos fenóis através de acoplamento oxidativo, podendo estes alternativamente ser transformados pelas vias metabólicas secundárias e convertidos a quinonas, por exemplo (Dec e Bollag, 1994).

As raízes geneticamente transformadas pela Agrobacterium rhizogenes podem ser utilizadas como modelos experimentais no estudo do metabolismo degradativo, assim como tem servido para o estudo da biossíntese de compostos vegetais bioativos. O presente trabalho teve como objetivos investigar a capacidade de remoção do fenol (F), 2-clorofenol (CF), 2,6-diclorofenol (DCF) e 2,4,6-triclorofenol (TCF) do meio de cultura pelas raízes transformadas de cenoura, estabelecer a correlação entre capacidade de remoção e a atividade das peroxidases nas raízes e determinar a duração do processo de remoção/bioconversão dos fenóis.

Todos os experimentos foram realizados com as culturas clonais B6 e B28 de raízes transformadas de cenoura (Araujo et al., 1999), individualmente e em triplicata. Cultivou-se um inóculo de raízes (0.05g) em 100 mL do meio GB (meio de Gamborg et al, 1968, diluído 50% e suplementado com 3% de sacarose) e incubou-se, no escuro, durante 21 dias, a 25±1^oC. No 21^o dia adicionou-se às culturas os fenóis separadamente, de modo a obter concentrações finais no meio de cultura correspondente aquelas toleradas, ou seja, 1 mM de fenol e 0.05 mM de clorofenóis. Paralelamente, foram testadas concentrações 2 vezes maiores, isto é, 2 mM de fenol e 0.1 mM de clorofenóis . Aos controles adicionou-se água destilada estéril. A remoção dos fenóis foi monitorada pela quantificação dos mesmos no meio de cultura e nos extratos das raízes após 24, 72, 120 e 240 horas após o início dos experimentos. A determinação quantitativa dos fenóis foi realizada através de HPLC em fase reversa (método modificado de Frébortová, 1995) utilizando como fase móvel uma mistura acetonitrila: 7mM ácido fosfórico nas proporções 70:30 para F e CF e 54:46 para DCF e TCF. A detecção espectrofotométrica ocorreu a 225 nm. Concomitantemente, determinou-se a atividade das peroxidases nas culturas antes da adição do fenóis e 24, 120 e 240 horas após a adição dos mesmos, de acordo com o método do guaiacol descrito em Kim e Yoo, 1996.

O fenol e os clorofenóis, quando presentes na concentração máxima tolerada eliciaram a atividade das peroxidases dentro das primeiras 24 horas após a adição ao meio de cultura, sendo que a atividade manteve-se elevada em relação aos controles dentro de um período de 10 dias (240 horas). Entretanto, quando estes compostos foram adicionados em quantidades duas vezes maiores, a atividade das peroxidases elevou-se dentro das primeiras 24 horas, porém decaiu rapidamente. Em ambos os casos, a remoção dos fenóis do meio de cultura foi superior a 90%. Parte do fenol absorvido pelas raízes foi degradado (aproximadamente 70 %) dentro dos primeiros dez dias após a adição dos mesmos, sendo que a porção restante ainda se encontrava acumulada no tecido radicular. Não foi observada a formação de polímeros insolúveis no meio de cultura.

A atividade das peroxidases nas raízes de cenoura foi eliciada pela presença dos fenóis nas concentrações máximas toleráveis e também nas concentrações tóxicas, mostrando que a remoção destes compostos e sua degradação está relacionada com as peroxidases presentes nas raízes. A queda abrupta da atividade destas enzimas após 24 horas, quando da adição de quantidades tóxicas dos fenóis (duas vezes maior que a concentração tolerável), sugere que o substrato ou os produtos do metabolismo inibiram as peroxidases. A dose mínima dos fenóis necessária para eliciar a atividade das peroxidases está sendo investigada e será relatada neste trabalho.

Referências bibliográficas

Araujo B. S. Araujo, B. S., Charlwood, B.V. and Pletsch, M (1999). Abs. of 2^nd IUPAC International Conference on Biodiversity, July 1999, Belo Horizonte, MG, Brazil, P142.

Gamborg O. L., Miller R. A. e Ojima K. (1968). Exp. Cell Res., 50, 151-158.

Dec J. e Bollag J. M. (1994). Biotechnol. Bioengin., 44, 1131-1139;

Frébortová J. (1995). Biosci. Biotech. Biochem., 59, 1930-1932.

Kim Y. H. e Yoo Y. J. (1996). Enz. Microb. Technol., 18, 531-535.

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