MÉTODO PARA DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO

DE ENZIMA IMOBILIZADA EM XANTATO DE CELULOSE


José Manoel Marconcini (PG)*, Célia Maria da Silva Oliveira (PQ)**


* Departamento de Química - Universidade Federal de Mato Grosso do Sul

79070-900 - Cidade Universitária - Campo Grande - MS - jmarcon@nin.ufms.br

** Departamento de Ciências Naturais-Universidade Federal de Mato Grosso do Sul Av. Ranulfo Marques Leal, 3484-79603-011-Três Lagoas-MS celiams@yahoo.com


palavras-chave: fosfatase alcalina, xantato de celulose, imobilização




Introdução: A imobilização de enzimas é um método de fixação ou encerramento de uma enzima em suportes sólidos, que possibilita diversas aplicações destes catalisadores, tais como, reutilização da enzima, separação de inibidores de enzimas, facilidade de separação do produto do catalisador, em processos analíticos e em reatores de fluxo contínuo1,2,3. Neste trabalho, propomos outra possibilidade de utilização de enzimas imobilizadas, a determinação da concentração de enzima imobilizada a partir de medidas cinéticas da reação de imobilização e da cinética enzimática. Através da reação do suporte xantato de celulose de p-nitrobenzila (CelXNB) com os grupamentos amina da fosfatase alcalina, o número de moles de enzima imobilizada pode ser obtido espectrofotometricamente através do acompanhamento cinético do produto da reação de imobilização, o p-nitrobenziltiol (NBT), (esquema 1).


Como a hidrólise espontânea do suporte é uma reação paralela à imobilização, estudou-se a influência desta hidrólise no CelXNB (esquema 2).



Obteve-se a massa de enzima imobilizada a partir da cinética enzimática, através da relação velocidade inicial de transformação do substrato versus concentração de fosfatase alcalina em solução.

Objetivos: Obtenção da concentração de enzimas no suporte CelXNB. Estimar o peso molecular da fosfatase alcalina usando o método de imobilização de enzimas.

Métodos: Os reagentes eram de grau analítico, utilizados sem purificação prévia. A fosfatase alcalina (E.C. 3.1.3.1) era da Sigma Chem. Co., cristalizada e liofilizada. Utilizou-se como suporte CelXNB com grau de substituição de 13,2. As medidas cinéticas foram realizadas em um espectrofotômetro Hitachi U-3000 UV/VIS. Nas cinéticas em fluxo, utilizou-se como agitador mecânico uma Mesa Agitadora TE-240 Pendular Tecnal, uma bomba peristáltica Milan modelo 204, um banho termostatizado TE-184 Tecnal e uma cubeta de fluxo de quartzo modelo 7Q Sterna. Para as medidas de pH, utilizou-se um pHmetro Hanna 8314. As imobilizações de enzima e reações de hidrólise foram acompanhadas espectrofotometricamente pelo aparecimento do p-nitrobenziltiol em 285 nm, em tampão carbonato, pH 11,0, 10% etanol (v/v). A atividade enzimática da fosfatase alcalina foi avaliada pelo acompanhamento cinético p-nitrofenol em 400 nm, tampão Tris-HCl pH 8,0, 0,01M.

Resultados e Discussão: As reações de hidrólise do CelXNB foram realizadas variando-se a concentração do tampão carbonato. A hidrólise foi catalisada pelo tampão, observando-se a seguinte relação: khid = kesp+kcat.[Na2CO3] onde khid é a constante de velocidade de hidrólise, kesp é a constante de velocidade de hidrólise espontânea da água e kcat é a constante de velocidade de catálise do tampão. Os valores das constantes de velocidade kesp e kcat obtidos foram, respectivamente 1,33.10-6.s-1 e 1,18.10-4.s-1. A relação obtida entre velocidade inicial de transformação do substrato (vo) e concentração de fosfatase alcalina em solução foi linear, vo = a + b.[fosfatase], e os valores obtidos de a e b são, respectivamente, -6,85.10-11 (mol.L-1)substrato.s-1 e 1,52.10-6 (mol.L-1)substrato.s-1 . (g-1.L)fosfatase . A atividade enzimática da fosfatase em solução foi de 1,01.10-8 (mol.L-1)substrato.s-1. A massa de fosfatase imobilizada na reação foi de 6,68.10-5g e o número de moles de NBT liberados de 5,31.10-10 mol. O peso molecular estimado da fosfatase alcalina é da ordem de 120.000 g.mol-1. A hidrólise é uma reação competitiva, com velocidade superior à imobilização, procurando-se, portanto, minimizá-la4.

Conclusão: O método proposto possibilita estimar o peso molecular de uma enzima, pois o método de imobilização apresenta-se geral. Também é possível determinar a massa de enzima imobilizada, verificando-se o rendimento da reação, o que possibilita melhor estimativa da catálise da enzima imobilizada.

Bibliografia:

1) Adachi, M., Yamazaki, M., Harada, M., Shioi, A., Katch, S., Biotechnology and Bioengineering, 53, 4, 406-408, 1997.

2) Licklider, L., Kuhr, W.G., Analytical Chemistry, 70, 9, 1902-1908, 1998

3) Bachinski, N., Panek, A.D., Paiva, C.L.A., Brazilian Journal of Medical Biological Research, 27, 1507-1516, 1994.

4) Humeres, E., Sequinel, L.F., Faistel, J.C., Nunes, M., Oliveira, C.M.S., Barrie, P.J., Atualidades em Físico-Química Orgânica, 340-360, 1986.



[PROPP-UFMS, CAPES e CNPq]