PRODUÇÃO DE LECTINAS POR CULTURAS DE RAÍZES

DE Bauhinia monandra (SABACEAE)

Adriana Carla Cavalcante Argôlo (PG)^1,2, Luana Cassandra B. B. Coelho (PQ)¹ e

Marcia Pletsch (PQ)²

¹Departamento de Bioquímica, Centro de Ciências Biológicas

Universidade Federal de Pernambuco, Cidade Universitária, 50670-420, Recife-PE

²Departamento de Química, Centro de Ciências Exatas e Naturais

Universidade Federal de Alagoas, BR 101 Norte, Km 14, 57072-970, Maceió-AL

Palavras-chave: lectinas, Bauhinia, raízes transformadas

As lectinas são glicoproteínas de origem não-imunológica, que podem ligar carboidratos e aglutinar células (Pusztai,1991). Por serem altamente seletivas para os carboidratos aos quais se ligam, as lectinas podem ser purificadas por cromatografia de afinidade. As lectinas foram isoladas originalmente de plantas (fitohemaglutininas), particularmente de sementes de leguminosas, e mostraram-se capazes de aglutinar hemáceas e outras células devido ao fato de possuirem dois ou mais sítios de ligação para as unidades glicídicas. Algumas lectinas são mitogênicas e estimulam transformações dos linfócitos; outras aglutinam preferencialmente células malignas e algumas estão envolvidas no reconhecimento célula-célula. Na superfície da maioria das células, podemos encontrar padrões de carboidratos que podem ser reconhecidos por uma ou mais lectinas através de ligações seletivas. Como um grupo de células não expressam padrões de carboidratos idênticos a outro tipo celular, as lectinas podem ser usadas para mostrar a diferença entre eles, auxiliando no diagnóstico.

A obtenção de raízes transformadas a partir de material vegetal é feita através da transformação mediada pela Agrobacterium rhizogenes (Potrykus & Spangenberg, 1995), a qual é usada como vetor para a transferência de genes e para a produção de raízes. As culturas de raízes transformadas geneticamente (hairy roots) representam uma das alternativas mais promissoras para a produção de compostos economicamente importantes, para a regeneração de plantas transgênicas com características fenotípicas desejáveis, para o incremento da biomassa radicular em plantas que apresentam dificuldade de enraizamento (recalcitrantes), para a produção de enzimas comercialmente importantes e para o estudo do metabolismo degradativo. Assim, grandes quantidades de biomassa de raízes transformadas produtoras de lectina poderão ser obtidas em biorreatores apropriados possibilitando a produção desta proteína através de um processo biotecnológico economicamente viável. O presente trabalho tem como objetivo estabelecer culturas de raízes axênicas e obter o maior número possível de culturas clonais de raízes transformadas de B. monandra, com o fim de estudá-las individualmente no que diz respeito aos seus caracteres morfológicos e bioquímicos, isto é, crescimento da biomassa, tipo e conteúdo de lectina.

As sementes de B. monandra foram esterilizadas com uma solução de água sanitária comercial BriluxÔ (2 a 6% de Cl₂ ativo) durante 30 min, seguidas por imersão em etanol (70%) durante 5 min, enxaguadas repetidamente com água destilada esterilizada e colocadas sobre meio de MS (Murashige & Skoog, 1962), suplementado com sacarose (3%) e ágar (1%). Plântulas jovens de B. monandra (2 meses), cultivadas in vitro, foram infectadas com A. rhizogenes cepa LBA9402, nas partes meristemáticas apical e axilar, através de agulha hipodérmica acoplada a seringa contendo a suspensão da bactéria previamente preparada. As plântulas foram incubadas a 25±1°C, sob luminosidade constante. Paralelamente, raízes de plântulas in vitro foram excisadas e colocadas diretamente em meio de cultura líquido (100 mL) contido em frascos cônicos de 250 mL. Dois meios de cultura básicos foram investigados para fins de manutenção das culturas de raízes e para incrementar o crescimento da biomassa: o meio de Gamborg B5 (1968) e o meio MS com e sem reguladores de crescimento, suplementado com sacarose (3%).

O aparecimento de raízes após infecção das plântulas com a A. rhizogenes foi observado entre 15 e 20 dias. O número de eventos de transformação foi baixo, ou seja, formaram-se apenas cinco a oito raízes por ponto de infecção. As raízes formadas (1 cm de comprimento) foram excisadas e colocadas individualmente sobre meio semi-sólido de Gamborg B5 diluído a 50% contendo ampicilina (400 mg/L). Dos 28 clones obtidos apenas três (BM2, BM9 e BM14) mostraram sinais de crescimento neste meio de cultura, ou seja, ocorreu alongamento da raiz principal, porém não se verificou a formação de numerosas ramificações como é o caso da maioria das culturas de raízes transformadas oriundas de outras espécies. Todos os demais clones pereceram. Surpreendentemente, as culturas de raízes axênicas não transformadas geneticamente desenvolveram-se em meio MS suplementado com ácido naftaleno acético (0,2 mg/L) e cinetina (0,2 mg/L) de modo mais rápido do que as raízes induzidas pela A. rhizogenes. A produção da biomassa das culturas de raízes axênicas não transformadas e dos clones geneticamente transformados de B. monandra mencionados acima nos vários meios de cultura testados será relatado neste trabalho. A confirmação da transformação genética das raízes está sendo realizada através de reação em cadeia com polimerase (PCR), usando-se oligonucleotídeos apropriados para a amplificação de um segmento do T-DNA transferido do plasmídeo Ri da bactéria para a planta e incorporado no genoma das raízes. A simbiose das raízes de B. monandra com os fungo micorriza, Gigaspora margarita (UFPE02) e Glomus tunicatum (UFPE06), objetivando estimular o crescimento das mesmas está sendo experimentada no presente momento.

CNPq, CAPES

Referências Bibliográficas

- Murashige, T. & Skoog, F. (1962). Physiol. Plant, 15, 473.

- Potrykus, I. & Spangenberg, G. (1995). Gene Transfer to Plants. p. 53. Springer-Verlag, Berlin.

- Pusztai, A. (ed.) (1991). Chemistry & Pharmacology of Natural Products - Plant Lectins. Cambridge University Press, Cambridge.