Estudos de Proteção da Célula de Saccharomyces cerevisiae para Utilização em Reações de Redução em Meio Orgânico


1Sandra Patricia Zanotto (PG), 1Maria da Graça Nascimento(PQ), 2Paulo José S. Moran (PQ). 1Departamento de Química, UFSC, 88040-900, Florianópolis, SC; 2Instituto de Química da UNICAMP, Cx Postal 6154, 13100-000, Campinas, SP.


palavras-chaves: Saccharomyces cerevisiae, biocatálise, imobilização


O Fermento de pão (FP), Saccharomyces cerevisiae, é um dos biocatalisadores conhecidos mais versáteis e baratos.Nas reações de redução de cetonas, o FP é utilizado preferencialmente na forma de célula inteira, ao invés das enzimas deidrogenases, evitando dessa forma, o problema da dificuldade de reciclar o cofator (NADH ou NADPH) que é necessário quando se usa a enzima pura. Se o processo não for satisfatoriamente seletivo, modificações simples nas condições experimentais podem influenciar tanto a estereoquímica bem como na enantiosseletividade. Algumas modificações mais comuns são o uso de solventes orgânicos, adição de inibidores, técnicas de imobilização, entre outras.

Este trabalho tem como objetivo realizar estudos de proteção do microorganismo da toxidade do solvente orgânico, fazendo-se a imobilização do FP em montmorilonita (K10) e recobrindo-se este complexo com gelatina. A atividade das células em reações de redução enantioseletivas do acetoacetato de etila (1) será testada para verificar a viabilidade de proteger a célula do solvente orgânico em repetidas reações com longa duração. Este sistema poderá também ser aplicado para a imobilização de outros tipos de microorganismos, inclusive cepas selecionadas em reações utilizando-se de solventes orgânicos.




Utilizou-se como suporte a Montemorilonita K10 (Aldrich Chemical Co.). Este suporte após a adsorção prévia do biocatalisador (Fermento de Pão seco “FP”, fabricado na Bélgica por N.V. Algist – Bruggeman S. Emulzint – LTDA, Saccharomyces cerevisiae), foi recoberto com gelatina, “G” (SIGMA, G2500, Tipo A).

Utilizou-se o seguinte procedimento geral para adsorção e recobrimento do FP. Preparou-se uma suspensão com 2,4g de FP belga seco e 7,2g de montemorilonita (K10), em 100mL de água. Deixou-se sobre agitação magnética vigorosa por uma noite, à temperatura ambiente. A seguir, filtrou-se a vácuo e secou sob corrente de ar. Após a mistura de FP/K10 estar seca, esta foi triturada em um gral até obter partículas finas para facilitar o recobrimento com gelatina.

Uma solução de 0,5g de gelatina em 5,0mL de água foi aquecida até 50oC, e a seguir deixou-se esfriar até + 30oC, para adicionar a mistura FP/K10 para que não ocorra danos nas células de Saccharomyces cerevisiae (FP), devido à alta temperatura. A mistura de FP/K10/G, foi seca sob corrente de ar e triturada.

Diferentes condições experimentais para a reação de redução do acetoacetato de etila (1) foram testadas. Além destas, reações de controle foram realizadas utilizando apenas fermento de pão sem ser imobilizado em montemorilonita K10 (Tabela 1).


Tabela 1- Diferentes condições experimentais utilizadas para avaliar a melhor metodologia a ser empregada nas reações de redução do acetoacetato de etila.

reação

H2O (mL)

FP (g)

K10 (g)

G (g/mL)

Sacarose (g)

Agitação

Temp.(oC)

FP/K10/mag*

1

1,6

2,4

7,2

_

_

magnética

t.a

FP/K10/G/mag*

2

1,6

2,4

7,2

0,1

_

magnética

t.a

FP/G/dub*

3

1,6

2,0

_

0,1

_

tipo-Dubnoff

25

FP/K10/sac/dub*

4

1,6

2,4

7,2

_

0,16

tipo-Dubnoff

25

FP/K10/G/sac/dub*

5

1,6

2,4

7,2

0,1

0,16

tipo-Dubnoff

25

FP-1sac*

6

2,6

2,0

_

_

0,16

tipo-Dubnoff

25

FP-2sac*

P*

2,6

2,0

_

_

0,16

magnética

t.a

FP-3*

P*

1,6

2,0

_

_

_

magnética

t.a

FP-3sac*

P*

1,6

2,0

_

_

0,16

magnética

t.a

FP-4*

P*

1,6

2,0

_

_

_

tipo-Dubnoff

25

FP-4sac*

P*

1,6

2,0

_

_

0,16

tipo-Dubnoff

25



As reações foram acompanhadas, periodicamente, através da técnica de cromatografia gasosa acoplado a um espectrômetro de massa (GC-MS-QP5000) da Shimadzu com uma coluna da Supelco (Simplicity 1 Capillary Columm, 30m x 0,25mm x 025mm, No 11702-05B).

Após 24 horas de reação, praticamente obteve-se 100% de área referente ao produto da reação, que é o 3-hidroxietil éster (2), com todos os sistemas testados.

Após este primeiro teste, todos os sistemas foram submetidos à reutilização, adicionando-se hexano (50,0mL) e a mesma quantidade de substrato (0,2mL acetoacetato de etila). Os sistemas foram testados até quatro reutilizações. Através das Figuras 1, 2 pode-se verificar que a partir da segunda reutilização, ou seja a terceira reação que o sistema foi submetido, as áreas que correspondem aos produtos da reação diminuíram significativamente. Pode-se assim constatar que neste sistema a célula de Saccharomyces cerevisiae não ficou suficientemente protegida levando à formação do produto em menos percentagens, após sucessívas reutilizações (60-40%), em meio orgânico.
















[ CNPq, UFSC, UNICAMP]