CONSTRUÇÃO E AVALIAÇÃO DE UM BIOSSENSOR AMPEROMÉTRICO PARA OXAL

CONSTRUÇÃO E AVALIAÇÃO DE UM BIOSSENSOR AMPEROMÉTRICO PARA OXALATO

Elizabeth Fátima Perez (PG)^*, Graciliano de Oliveira Neto (PQ)^**,

Lauro Tatsuo Kubota (PQ)^*

^*Instituto de Química- Unicamp Caixa Postal 6154 Campinas-SP

^**Faculdade de Farmácia-USF Bragança Paulista-SP

'palavras-chave' : determinação de oxalato, oxalato oxidase, horseradish peroxidase

1.Introdução:

O oxalato é um analito de grande interesse em análises clínicas, uma vez que sua alta concentração no sangue pode ocasionar a formação de calculus renais. Está presente na dieta humana, sendo encontrado em diversos vegetais, podendo ser resultado do metabolismo de amino ácido (glicina) ou ácido ascórbico. Ele afeta a nossa saúde de duas maneiras: após a sua absorção pelo organismo, produzindo sais insolúveis de cálcio (presente na circulação) que podem precipitar nos rins contribuindo para a formação de calculus renais; e antes da absorção, originando quelatos com o cálcio da dieta (não absorvidos), diminuindo a sua assimilação pelo organismo. Além disso, a alta concentração de ácido oxálico em capim pode prejudicar o sistema neurológico e levar a desmineralização no gado causando hipocalcemia, podendo causar a morte do rebanho. Dessa forma a sua quantificação em alimentos e em análises clínicas é muito importante. A quantificação de oxalato é realizada através de métodos espectrofotométricos, no qual a enzima não é reutilizada, o que eleva o custo da análise, ou por permanganometria, a qual gera muitos resíduos, além de ser muito trabalhoso.

Com base nestes fatos, este trabalho tem por objetivo o desenvolvimento de um biossensor bienzimático para a determinação de oxalato.

2.Parte Experimental:

As medidas eletroquímicas foram realizadas em um PGSTAT 20 Autolab da Eco Chimie, sendo a célula eletroquímica constituída por três eletrodos: o de referência, calomelano saturado (ECS), o auxiliar um fio de platina em espiral, e o de trabalho um eletrodo de pasta de carbono. As medidas foram feitas em tampão succinato 0,1 mol L^-1/ KCl 0,4 mol L^-1. O biossensor foi avaliado através da resposta para adições de oxalato de sódio, sendo estudado o efeito do pH do tampão, do potencial aplicado e do tempo de vida.

Sobre 10mg de sílica gel quimicamente com óxido de titânio¹ contendo azul de toluidina adsorvido, imobilizou-se 0,71U da enzima oxalato oxidase (OXO) com o auxílio de 3 µL de glutaraldeído 2,5% (m/V) dissolvidos em 60 µL do tampão succinato utilizado nas medidas eletroquímicas e seca em temperatura ambiente. A adsorção de 60U da enzima horseradish peroxidase (HRP) foi feita sobre grafite em pó previamente ativado com carbodiimida, preparado segundo descrito na literatura². A pasta de carbono foi preparada pela mistura desses dois materiais, depois de secos, utilizando-se nujol como aglutinante.

3.Resultados e discussão:

O biossensor foi construído utilizando-se duas enzimas: a OXO decompõe o oxalato em CO₂ e H₂O₂ sendo regenerada pelo oxigênio, e a HRP que catalisa a redução de peróxido. Essa segunda enzima foi acoplada ao biossensor para amplificar o sinal gerado pelo eletrodo. Dessa forma a resposta obtida é referente a regeneração da HRP no biossensor que é proporcional ao oxalato da amostra.

O estudo da variação do pH do tampão não mostrou uma grande dependência do mesmo na resposta do biossensor, apesar do sinal gerado ser um pouco maior em pH 3,3, as medidas foram realizadas em pH 3,8 (pH ótimo para OXO), visto que meio mais ácido poderia afetar o tempo de vida da HRP. Valores maiores de pH apresentaram respostas inferiores.

Observou-se um patamar na resposta do biossensor quando aplicado potencial igual -150 mV, esse valor é muito negativo e pode apresentar interferência do oxigênio do meio além de desnaturar as enzimas. Dessa forma optou-se pela aplicação de -100 mV, pois potenciais mais positivos apresentaram resposta muito inferior. O eletrodo apresentou boa faixa de resposta linear entre 0,1 e 2 mmol L^-1, sendo o tempo e resposta (tempo entre a injeção e o máximo de resposta) de 0,5 s. O biossensor quando estocado em tampão succinato na geladeira apresentou tempo de vida de quatro dias (ou 80 determinações). A aplicação do biossensor em amostras reais de espinafre, mostrou um erro de 7 e 13 % em relação ao método de referência da AOAC, apesar do erro ser elevado o biossensor mostrou ser um método mais simples, visto que o de referência despende quatro dias e o proposto apenas um . O erro também pode estar relacionado com possíveis perdas durante a execução do método de referência.

4. Conclusões:

O biossensor não apresentou grande dependência do pH frente a sua resposta, sendo por isso utilizado o pH ótimo da própria enzima para as análises subseqüentes. Apesar de obter-se maior resposta do biossensor, com aplicação do potencial de -150 mV, ele não pôde ser utilizado, pois diminui o tempo de vida da enzima HRP e está sujeito a interferência de oxigênio, dessa forma aplicou-se –100 mV. O biossensor exibiu uma faixa de resposta linear de 0,1 à 2 mmol L^-1 para oxalato, com tempo de resposta de 0,5 s, possibilitando 80 determinações com o mesmo biossensor.

5.Bibliografia:

1.Kubota, L. T.; Gushikem, Y.; Castro, S.; Moreira, J. C.; Colloids Surf.; 57, 1991, 11.

2.Popescu, I. C.; Zetterberg, G.; Gorton, L.; Biosen. Bioelectron.; 10, 1995, 443.

FAPESP, PRONEX, CNPq