DETERMINAÇÃO DE SALICILATO EM AMOSTRAS DE INTERESSE CLÍNICO ATRAVÉS DE BIOSSENSOR A BASE DE FIBRAS DE CARBONO

Rosangela . M. de Carvalho (PG)^a, Graciliano de Oliveira Neto (PQ)^b e Lauro T. Kubota (PQ) ^a

^a Instituto de Química , UNICAMP, CP 6154, 13083-970, Campinas - Brasil.

^b Faculdade de Ciências Farmacêuticas, USF, 12900-000, Bragança Paulista - Brasil.

Palavras-chaves: Fibras de carbono, Biossensor para salicilato, Salicilato hidroxilase

Os salicilatos são usados na medicina em várias formas derivadas. As propriedades tóxicas do ácido salicílico requerem controle de sua quantidade no plasma sangüíneo e urina de pacientes que fazem uso contínuo de medicamentos contendo derivados de salicilato. Os salicilatos também devem ser monitorados em produtos dermatológicos e em alimentos, onde são usados para preservação¹. Das muitas metodologias empregadas para determinação de salicilato, pode se destacar as amperométricas, pois possuem alta sensibilidade, baixo limite de detecção e curto tempo de resposta. A necessidade da construção de um biossensor para salicilato está ligada ao fato de sua pequena diferença entre a dose terapêutica (1,1 a 2,2 mmol L^-1) e a dose tóxica (concentrações acima de 2,2 mmol L^-1)¹. Então, um método rápido, efetivo e sensível é desejável para diagnóstico de intoxicações por salicilato. A procura por um método que preencha os requisitos e necessidades descritas acima, motivaram à pesquisas para desenvolver um biossensor para salicilato. O biossensor desenvolvido, envolve o uso da enzima ”salicilato hidroxilase” (SH), que converte o salicilato à catecol e dióxido de carbono na presença de NADH e oxigênio. Neste caso a detecção é feita através do catecol formado, que é então oxidado na superfície do eletrodo de fibra de carbono para o-quinona, num potencial fixo de 300 mV em relação ao eletrodo de referência.

O eletrodo foi construído com cerca de 50 fibras de carbono (Toray- T800H), as quais foram inseridas em um tubo de polietileno de 3 mm de diâmetro, deixando aproximadamente 4 mm de fibras expostas e selando a junção por aquecimento. O contato elétrico foi feito com fio de cobre e pasta de carbono condutora (Leit-C condutive carbon cement, Neubauer Chemikalien). Após a construção, foi pré-tratado eletroquimicamente em potencial fixo de +800 mV por 30 s. O mesmo foi modificado por ligação covalente com carbodiimida tendo como base a metodologia utilizada por Csöregi e colaboradores². O eletrodo foi imerso em 500 ml de uma solução de carbodiimida (1,4 mg L^-1 preparada em tampão acetato 0,05 mol L^-1, pH 4,8), durante 60 mim e então lavado com água destilada e seco em temperatura ambiente por 60 mim. O passo seguinte foi a imobilização da enzima “salicilato hidroxilase” ( E.C. 1.14.13.1, Sigma). O eletrodo foi imerso em 300 ml de solução de enzima (SH) (11 mg mL^-1 , pH 7,5 ajustado com tampão fosfato), por 15 mim. Após este passo, o biossensor foi seco em temperatura ambiente por mais 60 mim e estocado em refrigerador.

As amostras analisadas foram: medicamentos e urina. As amostras de fármacos foram compradas em uma farmácia local (comprimidos com valor quantitativo nominal de 85 mg de ácido acetil salicílico). Estas amostras de ácido acetil salicílico foram hidrolizadas adicionando 10,0 mL de NaOH 0,5 mol L^-1 e depois as misturas foram aquecidas por 1 h, seguidas pela neutralização com H₂SO₄ 0,5 mol L^-1 e transferidas quantitativamente para balões volumétricos de 50,00 mL[28]. O volume foi completado com água desmineralizada e as diluições necessárias foram feitas com tampão fosfato 0,2 mol L^-1, pH 7,6. As amostras de urinas foram neutralizadas com NaOH e as diluições foram feitas nas mesmas condições. Todas as amostras foram analisadas em triplicata pelo o biossensor e método de referência³.

A resposta do biosensor em nA é linear para a concentração de salicilato entre 1,00 10^-7 e 1,93 10^-6 mol L^-1 (i=-2,69 + 5,0 10⁷ [salicilato(mol L^-1)], para n=24 com r= 0,9991) e 1,96 10^-6 e 1,20 10 ^-5 mol L^-1 (i= 12,20 +2,08 10⁷ [salicilato (mol L^-1)], para n=13 com r= 0,9994), com um limite de detecção de 5,57 10^-8 mol L^-1 (considerando 3 vezes o sinal do ruído), para um biossensor recentemente preparado, com desvio padrão relativo de 4,12 % (n=10). Os resultados obtidos nas análises são apresentados na Tabela 1 e demonstram que o método proposto pode ser aplicado tanto em amostras de medicamentos quanto para amostras biológicas.

Em conclusão pode se dizer que o sistema apresentado combina as vantagens das fibras de carbono com a simplicidade da detecção eletroquímica. A imobilização covalente da enzima no eletrodo de fibras de carbono através de carbodiimida resulta em um sensor amperométrico com alta sensibilidade e baixo limite de detecção. A resposta eletrocalítica observada é eficiente na eletroxidação do catecol, quando comparado com a literatura onde altos valores de potenciais são aplicados. A boa performance do biossensor na determinação em amostras reais de forma barata, rápida e simples, tornando o biossensor bastante prático.

Tabela 1 – Resultados da determinação de salicilato obtidos pelo biossensor e pelo método de referência

Referências

1- Rover Jr, L..; Oliveira Neto, G. de e Kubota, L. T., Electroanalysis 11(1999)527.

2- Csöregi, E.; Gorton, L. e Marko-Varga, G., Anal. Chim. Acta, 273 (1993) 59.

3- McDonald, R. P. , “Standard Methods of Clinical Chemistry”, vol.5, Academic Press, New York, 1965, p.237.

[CNPq e FAPESP]