DETERMINAÇÃO DE SALICILATO EM SORO POR ANÁLISE ENZIMÁTICA ESPECTROFOTOMÉTRICA E SISTEMA FIA

Marta Maria Duarte Carvalho Vila (PG)*, Matthieu Tubino (PQ)*,Graciliano de Oliveira Neto (PQ)**

* Departamento de Química Analítica - Instituto de Química - Unicamp

**Centro de Ciências Biológicas e da Saúde - Universidade São Francisco

"palavras chave" : enzima , salicilato , FIA

Introdução: O ácido acetilsalicílico foi sintetizado, pela primeira vez, em 1897 e introduzido na clínica médica em 1899 com o nome de (aspirinaâ). Suas características analgésicas, antitérmicas e antiinflamatórias fizeram deste fármaco um sucesso, que perdura até os dias de hoje. No Brasil ocupa a terceira posição no mercado de analgésicos com consumo de 2,8 bilhões de doses anuais o que equivale a 300 milhões de dólares/ano. Atualmente, tem prescrições variadas que vão do tratamento da dor de cabeça a prevenção de doenças cardíacas (1). A absorção do ácido acetilsalicílico ocorre no estômago e na porção proximal do intestino delgado, sendo hidrolisado em sua maior parte em ácido salicílico. A faixa de concentração no plasma ou soro para ótimo efeito antiinflamatório situa-se entre 150 a 300mg/mL. Entretanto, é estreita a margem terapêutica, pois os primeiros sinais de intoxicação estão próximos a 300 mg/mL. Além do mais, casos de intoxicação por ingestão acidental, bem como superdosagens em pacientes com enfermidades crônicas não são raros (2). Deste modo, existe a preocupação do monitoramento do nível de salicilato no soro sangüíneo desde a década de 40. Diversas formas de dosagem são descritas na literatura, podendo-se citar: técnicas cromatográficas, colorimétricas, potenciométricas, fluorimétricas, entre outras. Os maiores problemas, geralmente, residem na necessidade de separação da espécie analisada, interferência de outros compostos presentes na matriz e uso de sistemas de detecção sofisticados. Os métodos enzimáticos tem surgido como uma opção de análise rápida, com especificidade e que podem ser realizados diretamente na amostra. Soma-se a isto, a possibilidade da imobilização enzimática sobre suporte insolúvel o que permite o emprego das reações enzimáticas integradas em sistema contínuos para a automatização do processo (3).

Objetivo: O trabalho visou desenvolver metodologia enzimática espectofotométrica automatizada para a determinação de salicilato em amostras de soro sangüíneo .

Métodos: A determinação de salicilato via reação enzimática, envolve a enzima salicilato hidroxilase (E.C. 1.14.13.1) de acordo com a seguinte reação:

salicilato + NADH +O₂ ® catecol + NAD⁺ + H₂0 + CO₂

A dosagem de salicilato foi feita pela determinação espectofotométrica do produto da reação do catecol gerado com o reagente 4-aminofenol em meio básico e comprimento de onda de 565 nm (4). A adsorção enzimática foi feita em meio orgânico sobre pérolas de vidro de porosidade controlada. A enzima imobilizada é, então, empacotada em tubos de polietileno constituindo o reator enzimático que é integrado em sistema de injeção em fluxo espectrofotômetrico.

Resultados e Conclusão: Verificou-se para a otimização do processo as seguintes variáveis: temperatura, pH, proporção de salicilato/cofator e velocidade de fluxo. Optou-se pela temperatura ambiente (25°C) pela facilidade de trabalho e por considerar que os resultados a esta temperatura, correspondem a cerca de 70% dos da temperatura mais eficiente (35°C). O pH de 7,6 foi escolhido por ser este o recomendado para a enzima na forma livre e por apresentar os melhores resultados. Das relações salicilato/cofator pesquisadas a de 1/3 foi considerada a melhor, pois obteve-se máxima eficiência com o menor consumo de cofator. A velocidade de vazão escolhida foi de 0,6mL/min. A velocidade de fluxo é uma variável de significativa importância nas reações enzimáticas, uma vez que, o maior contato entre enzima e substrato permite maior eficiência. Após determinadas as melhores condições, a aplicação em amostras reais foi testada utilizando-se o método da adição de padrão. Empregou-se amostras de soro sangüíneo gentilmente cedidas pelo Hospital de Clínicas da Unicamp dopados com salicilato de sódio numa faixa de concentração de 0,5.10^-3 a 5.10^-3 mol/L, procurando atingir valores próximos aos terapêuticos. Os resultados obtidos, apresentados na tabela abaixo indicaram uma faixa de recuperação de 93,0 % a 107,5%.

Tabela-1 Teste de recuperação de salicilato em amostras de soro.

Pelos resultados observados pode-se concluir que o método desenvolvido é perfeitamente aplicável para análise de salicilatos em soro. Além disto, somam-se as vantagens inerentes ao processo FIA, como o consumo reduzido de reagentes e amostra (150mL) e a possibilidade de analisar um grande número de amostras num curto período de tempo. A imobilização em pérolas de vidro em meio orgânico mostrou-se adequada, permitindo até 60 determinações por hora e uma vida útil de 1 mês, possibilitando análise seletiva, sem pré-tratamentos da amostra. O emprego de metodologia espectrofotométrica proporcionou boa qualidade de resultados e simplicidade operacional.

Referências Bibliográficas:1- Fontes, L. L. Sagra e Cia 1:24-25,1998; 2-NIETSCH, P. Therapeutic applications of aspirin. Germany. Bayer, 1989,69p.; 3-SCHMIDT, H.; BECKER, T.; OGBOMO, I. et al. Talanta 43:937-942, 1996.; 4-CHUBB, S. P. A ;CAMPBELL, R. S.; RAMSAY, J. R. et al. Clin. Chem. 155:209-220,1986.

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