OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE ANÁLISE NA DETERMINAÇÃO ESPECTROFOTOMÉTRICA DE GLUTATIONA REDUZIDA

Laércio Rover Júnior^a (PQ), Adriana Paula Vellasco^a (PG), Nelci Fenalti Höehr^a (PQ),

Arnaldo César Pereira^b (PG) e Lauro Tatsuo Kubota^b (PQ)

^aFaculdade de Ciências Médicas - UNICAMP - CP 6111 - 13083-970 - Campinas/SP

^b Instituto de Química - UNICAMP - CP 6154 - 13083-970 - Campinas/SP

Palavras-chave: glutationa reduzida, estabilidade química, planejamento fatorial.

Glutationa, um tripeptídeo (g-L-glutamil-L-cisteinil-glicina), existe no organismo em suas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG), atuando direta ou indiretamente em muitos processos biológicos importantes, incluindo metabolismo e proteção celular. Em particular, problemas na síntese de glutationa estão associados a algumas doenças, nas quais os níveis de glutationa e enzimas que atuam no seu metabolismo podem ser significativos na avaliação do estresse oxidativo. Mudanças na concentração deste tripeptídeo podem ser um indicador útil em certas desordens fisiológicas como alterações dos estados antioxidantes¹.

Alguns métodos têm sido empregados na análise de glutationa (GSH), dos quais a reação com o ácido 5,5’-ditio-bis-(2-nitrobenzóico), DTNB (reagente de Ellman), é utilizada como método de referência² para monitorar-se a quantidade GSH, avaliada pela absorbância (412 nm) devido ao produto resultante da reação de GSH com DTNB que gera o ácido 2-nitro-5-mercapto-benzóico (TNB) de cor amarela:

GSH + DTNB GS-TNB + TNB

Apesar da importância deste tripeptídeo, pouca atenção tem sido dada à estabilidade da glutationa em sua forma reduzida, que pode sofrer oxidação em função de impurezas presentes em solução como metais, além do valor de pH e solução tampão, fatores estes que causariam erros durante uma análise prejudicando a interpretação dos resultados. Baseado neste contexto, foi feita a avaliação de alguns parâmetros que influenciassem na estabilidade de GSH, como o tipo, pH e a concentração de tampão. Dependendo das condições empregadas, há uma diminuição na absorbância em 412 nm, verificada pela reação de GSH com DTNB 4,0 10^-4 mol L^-1. Curvas típicas de calibração com DTNB têm faixa linear para GSH entre 4,0 10^-6 e 1,0 10^-4 mol L^-1. Utilizando um espectrofotômetro UV-visível Pharmacia Biotech (U-2000), registrou-se os espectros de absorção de 360 a 560 nm de soluções de GSH 4,0 10^-4 mol L^-1 após a reação com o reagente de Ellman.

Os ensaios foram feitos logo após o preparo das soluções em água deionizada, medindo a variação de absorbância após 1 minuto de ensaio. No planejamento fatorial 2³, foram empregados tampões do ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etano-sulfônico, HEPES (+) e fosfato (-) em pH 8,8 (+) e 7,0 (-) e concentrações 0,25 (+) e 0,05 (-) mol L^-1. Em todas as soluções foi utilizado Na₂H₂EDTA 1,0 10^-4 mol L^-1. Estas são condições usualmente empregadas na análise de GSH, incluindo os métodos enzimáticos utilizando glutationa peroxidase e glutationa oxidase, devido ao pK_a=8,3 do resíduo de cisteína da molécula de GSH. Entretanto, em valores mais altos de pH pode ocorrer a oxidação catalisada por íons OH^-, interferindo na análise de GSH.

Em estudos preliminares foi observada uma velocidade de reação mais lenta em valores de pH 7,0 e concentração 0,05 mol L^-1. O equilíbrio é atingido após 5 minutos de reação, enquanto que em pH 8,8, a reação completava-se em menos de 1 minuto, sem variação da absorbância após reação com DTNB, e com maior sensibilidade. Porém em tampão HEPES, mesmo em pH 8,8 houve uma diminuição na absorbância a partir de 80 minutos, enquanto que em fosfato, não houve alteração por cerca de 4 horas das soluções de GSH. Isto indica que tampões zwiteriônicos favorecem a decomposição de GSH não sendo indicados na análise deste tripeptídeo.

Com relação ao planejamento fatorial de dois níveis e 3 fatores, também foram observadas alterações no comportamento das soluções de GSH em pH 7,0, particularmente em tampão HEPES (Fig. 1). A influência dos efeitos principais em ordem crescente foi: concentração (C), tampão (T) e valor de pH. Para decidir se haviam efeitos de interação de 2 e 3 fatores, foi aplicado o teste de t-Student com um intervalo de 95% de confiança, encontrando-se efeitos de interação significativos entre tampão e pH. Em valores de pH 7,0 e tampão 0,05 mol L^-1, houve maior alteração na absorbância das soluções de GSH, tanto em tampão HEPES como em fosfato.