AVALIAÇÃO DA CINÉTICA ENZIMÁTICA UTILIZANDO EXTRATOS VEGETAIS
Ileana Facchin (PQ)a, Maria del Pilar T. Sotomayor (PG)b, Gisele G. Bortoleto (IC)b, Simone B. Shimokomaki (IC)b e Lauro T. Kubota (PQ) b.
a ICS – Universidade Paulista - Objetivo – CEP 13043-900 – Campinas - SP
b IQ – Universidade Estadual de Campinas – CEP 13083-790 – Campinas – SP
Palavras-chave: peroxidase, cinética enzimática, extração.
A avaliação da cinética enzimática é de extrema importância no ensino de bioquímica, dado o grande número de processos biológicos, que envolvem na maioria complexos enzimáticos. Também merece destaque o uso de enzimas na biotecnologia, como no controle de processos fermentativos. No entanto, uma grande dificuldade encontrada é o custo elevado das enzimas, associado algumas vezes, ao problema de importação. Assim sendo, este trabalho propõe um método rápido de baixo custo para obtenção da enzima peroxidase, a partir de fontes naturais, buscando abordar desde a extração ao estudo de cinética enzimática. Deve-se ressaltar que, devido à biodiversidade brasileira, inúmeras plantas com diversas enzimas podem ser utilizadas com esta finalidade.
A peroxidase foi extraída do nabo, do qual pode-se obter facilmente um extrato rico nesta enzima. As reações químicas catalisadas por esta enzima são de grande importância biológica, cujo mecanismo pode ser resumido nas seguintes equações1:
Peroxidase nativa(Fe3+) + H2O2 Composto-I + H2O (equação I)
Composto - I + AH2 Composto-II + AH* (equação II)
Composto - II + AH2 Peroxidase nativa (Fe+3) + AH* + H2O (equação III)
onde a espécie AH2 é o doador de elétrons; peroxidase nativa (Fe3+) indica o estado ativo da enzima (ferri-peroxidase) e o H2O2 é o substrato, que também poderá ser um peróxido orgânico.
No caso em questão o extrato foi obtido triturando 100 g de nabo em liqüidificador com 40 mL de solução tampão fosfato 0,1 mol L-1 (pH 7,0). Esta mistura foi filtrada e a solução obtida foi estocada a 5 0C, até seu uso. Como uma tentativa de aumentar o tempo de vida do extrato, as amostras de nabo foram irradiadas (0,1 kGy - 60Co) antes da extração da peroxidase.
Para a obtenção das curvas cinéticas de peroxidase (Figura 1), foram feitas medidas a 25 oC em 510 nm de um complexo colorido, resultante da mistura do extrato enzimático, fenol, aminoantipirina e peróxido de hidrogênio em tampão fosfato, pH 7,0, tal como recomendado2.
Os resultados mostraram que estes extratos irradiados apresentaram atividade por período maior que 70 dias, o que possibilitaria o uso deste extrato ao longo de um semestre letivo completo.
Com os dados obtidos foi possível construir o gráfico do duplo recíproco de Lineweaver-Burk3 (Figura 2), e a partir deste gráfico obter parâmetros cinéticos da enzima peroxidase tais como o valor da constante de Michaelis-Mentem, KM, (1,4 x 10-4 mol L-1) e da velocidade máxima, Vmax, de decomposição do peróxido pela enzima peroxidase extraída de fonte natural ( 0,024 mmol min-1), além das unidades enzimáticas por volume do extrato.
Figura 1 : Curvas cinéticas mostrando a decomposição do H2O2 na presença da peroxidase. Obtidas após 70 dias de extração.
Figura 2 : Gráfico do duplo recíproco mostrando como são obtidas as constantes cinéticas KM e Vmax a partir dos dados apresentados na Figura 1.
Desta forma, demonstrou-se que é possível efetuar ensaios simples e de baixo custo para reforçar os conceitos de aulas expositivas, as quais, em geral, apresentam difícil entendimento. Neste caso específico, pode-se concluir que esta forma de ensino da atividade enzimática pode proporcionar uma maior compreensão do aluno, no que diz respeito ao significado dos parâmetros cinéticos e fontes de enzimas, além disto pode dar uma visão ao aluno do processo de extração de enzimas.
Bibliografia:
Ruzgas, T.; Csöregi, E.; Emnéus, J.; Gorton, L.; Marko-Varga, G.; Anal. Chim. Acta 1996, 330, 123-138.
Emerson, E.; J. Org. Chem. 1943, 8, 417-428.
Voet, D.; Voet, J. G.; Biochemistry, 2nd ed., Wiley, New York, 351 (1995).
IBRAS; CNPq; FAPESP