determinação de NADH empregando Sistema de Análise
por INJEÇÃO EM FLUXO COM DETEÇÃO Amperométrica EM Eletrodos de pasta de carbono modificados
com 3,4-Diidroxibenzaldeído

Maria Flávia Delbem^a (PG); Jairo José Pedrotti^b (PQ),
Ivano Gebhardt. Rolf Gutz^a (PQ ) e Silvia Helena Pires Serrano^a (PQ)

^aDepartamento de Química Fundamental - Instituto de Química USP

e-mail: shps@quim.iq.usp.br

^b Departamento de Química – Universidade Mackenzie, São Paulo

Palavras - chave: mediadores, detecção amperométrica, FIA

Introdução e Objetivos: Os cofatores enzimático b-nicotinamida adenina dinucleotídeo
(NADH) e b-nicotinamida adenina dinucleotídeo-fosfato (NADPH) são fundamentais para a ação catalítica de mais de 300 enzimas óxido redutases. A oxidação eletroquímica de ambos os cofatores é importante devido ao fato de que inúmeros substratos não eletroativos, podem ser indiretamente determinados, se a reação enzimática produz ou consome NADH ou NADPH, ambos eletroativos. Assim, ao quantificar-se eletroquimicamente o produto, NADH e/ou NADPH, quantifica-se indiretamente o substrato não eletroativo. A oxidação dessas espécies em eletrodos limpos tem um mecanismo complexo, ocorrendo a potenciais altamente positivos e dependentes da condição superficial do eletrodo. Além disso, os produtos da oxidação, NAD⁺ e NADP⁺ adsorvem na superfície do eletrodo, causando envenenamento superficial, acentuado pela utilização de tampão fosfato como eletrólito suporte^(1,2). Mais recentemente, eletrodos de carbono vítreo modificados com filmes eletropolimerizados de diversos derivados de 3,4-diidroxibenzaldeído (3,4-DHB) têm sido descritos para determinação de NADH^(3-6). O objetivo deste trabalho foi utilizar eletrodos de pasta de carbono modificados com filmes eletropolimerizados de 3,4-DHB, previamente desenvolvidos⁽⁶⁾ para determinação amperométrica de NADH em sistemas de análise por injeção em fluxo (FIA).

Métodos: Todos os reagentes utilizados foram de grau analítico e as soluções preparadas com água deionizada. Soluções de NADH foram preparadas em tampão PIPES 0,1 mol L^-1, pH 6,8 e mostraram-se estáveis durante 7 dias, quando mantidas ao abrigo da luz em geladeira. As leituras de pH foram efetuadas utilizando-se o pH-metro modelo 654 e um eletrodo de vidro combinado 6.0205.100 (OE), ambos Metrohm. Uma célula de camada delgada construída, em nossos laboratórios com blocos usinados em acrílico, com volume interno da ordem de 13 mL, foi empregada nas medições em fluxo. O sistema FIA consistiu de uma bomba peristáltica Gilson modelo Miniplus 3, um injetor de amostras manual provido de uma alça de amostragem de 160 mL, um sistema de remoção de bolhas de ar e o detector amperométrico com eletrodo de pasta de carbono modificado com filme eletropolimerizado de 3,4-DHB. As medições amperométricas foram feitas com um potenciostato (Eco Chemie, Autolab modelo PGSTAT 20), acoplado ao software GPS 3.1. O potencial do eletrodo de trabalho na célula eletroquímica em fluxo foi mantido em 0,23 V vs. Ag/AgCl (KCl saturado), suficiente para assegurar a oxidação de NADH na superfície do eletrodo modificado.

Resultados e Conclusões: Um dos atrativos no sistema FIA proposto para a determinação de NADH foi a introdução de um reator de polipropileno microporoso de 0,28 mm de d.i. e 50 cm de comprimento entre o injetor de amostras e o detector eletroquímico. Este tubo micropososo, originalmente utilizado na área médica (Oxyphan^Ò), mostrou-se eficiente para a remoção completa de micro bolhas de ar que se formam ao longo do percurso analítico, introduzindo instabilidade no sinal da linha base e falta de repetibilidade na altura das correntes de pico. Devido à fragilidade mecânica do tubo microporoso (parede de ~ 100 mm), este foi montado concentricamente no interior de um tubo protetor de polietileno, de diâmetro interno de 0,8 mm. Os dois tubos foram fixados entre si, nas extremidades, com cola epóxi.

Observou-se maior durabilidade do filme polimérico do eletrodo quando este é exposto a tampão fosfato (0,1 mol L-1, pH 6,8), ao invés do tampão PIPES, como fluido transportador do sistema FIA. Assim, somente as amostras de NADH a determinar foram injetadas em tampão PIPES (0,1 mol L-1, pH 6,8).

O estudo de vazão revelou que a faixa ótima de trabalho estende-se de 0,2 a 0,7 mL min-1. Vazões superiores a 0,8
mL min-1 diminuem a estabilidade do filme modificador e a repetibilidade dos picos registrados.

A repetibilidade do método para injeções de solução de NADH 25 (mol L-1 foi de 1,6% (18 injeções de 160 (L) e o limite de detecção foi estimado em 0,4
(mol L-1 (3S/R) Sob vazão de 0,6 mL min-1, a freqüência analítica do método foi de 55 determinações/hora.

R= 0,9997

Bibliografia:

(1) E. Katekawa; F. Maximiano; L.L.Rodrigues.; M.F.Delbem.; S.H.P.Serrano; Anal. Chim. Acta, 385, 345 (1999).

(2) L. Rover Jr.; J.C.B. Fernandes; G. de Oliveira Neto, L.T. K, Kubota, E. Katekawa, S.H.P. Serrano, Anal. Biochem. 260, 50 ( 1998 ).

(3) F. Pariente; F. Tobalina; G. Moreno e L. Hernándezo; E. Lorenzo e H. D. Abruña, Anal. Chem., 68, 4065 (1997).

(4) F. Pariente, F. Tobalina, M. Darder, E. Lorenzo e H. D. Abruña, Anal Chem., 68, 3135 (1996).

(5) F. Pariente, E. Lorenzo e H. D. Abruña, Anal Chem., 66 (1994), 4337.

(6) M. F. Delbem e S. H. P. Serrano, Anais do XI SIBEE, pag. 78 (1999).

FAPESP, CNPq