MÉTODO SIMPLES PARA DETERMINAÇÃO DE POTENCIAL ANTIOXIDANTE EM PRODUTOS NATURAIS BASEADO EM QUIMILUMINESCÊNCIA

Erick Leite Bastos (PG)^a, Paulete Romoff (PQ)^b, Hellen Paulin Caravielo (IC)^b
e Wilhelm Josef Baader (PQ)^a

^a Universidade de São Paulo - Instituto de Química

C.P. 26077 - 05599-970. São Paulo, SP

^b Instituto Presbiteriano Mackenzie – Faculdade de Ciências Exatas e Experimentais

elbastos@iq.usp.br

palavras-chave: antioxidantes, produtos naturais, quimiluminescência, luminol

Introdução

Na última década o estudo do envolvimento do estresse oxidativo na patofisiologia de diversas doenças crônicas, como doenças cardiovasculares e câncer, indica que substâncias antioxidantes desempenham um papel fundamental na prevenção destas patologias. Diversos métodos são utilizados atualmente para determinar atividade antioxidante total de fluidos corporais, misturas complexas e substâncias isoladas. Ensaios simples de seqüestro, como o TRAP¹ (“total reactive antioxidant potential” ou “total radical-trapping antioxidant parameter”) ou o TEAC (“trolox equivalent antioxidant capacity”) têm grande aceitação por apresentarem grande sensibilidade e facilidade de operação. Lissi et al ² desenvolveram uma variação do método de avaliação de TRAP que utiliza a quimiluminescência do luminol iniciada por 2,2´-azobis-(2-amidinopropano) (ABAP), estendendo o procedimento para a avaliação da capacidade do aditivo em diminuir a concentração de radicais livres no estado fundamental, originando um novo índice antioxidante conhecido como TAR (Reatividade Antioxidante Total). Este parâmetro constitui um índice útil capaz de modular o dano associado ao aumento da produção de radicais livres.

Objetivos

Desenvolver um ensaio de baixo custo e simples procedimento, baseado na oxidação quimiluminescente de luminol por peróxido de hidrogênio catalisada por hemina, para investigar a presença de substâncias que possuam capacidade antioxidante em misturas complexas, extratos de plantas e seus produtos isolados.

Métodos

A reação quimiluminescente de luminol com peróxido de hidrogênio, catalisada por hemina, é utilizada para a determinação da atividade antioxidante das amostras. Esta reação ocorre com o envolvimento de diversas espécies radicalares, que podem ser seqüestradas por substâncias que apresentem potencial antioxidante, resultando em uma diminuição da intensidade de emissão observada proporcional à concentração de antioxidante adicionado. Para a padronização do ensaio utiliza-se trolox, um análogo hidrossolúvel da vitamina E. As medidas são executadas em dois fluorímetros: um SPEX Fluorlog 1681 em celas de quartzo e em um luminômetro EG&G Lumimat em placas com 96 celas, a 25 ºC.

Resultados e Discussão

Após estudo cinético do sistema luminol, peróxido de hidrogênio e hemina, foram obtidas curvas de emissão quimiluminescente que apresentam constantes de decaimento lento, indicando uma concentração praticamente constante de radicais no Estado Estacionário no meio reacional, condição fundamental para validação da metodologia. ³ Conseguiu-se ainda, através do estudo das constantes de equilíbrio entre hemina e hematina e entre hemina em suas formas monomérica e dimérica, atingir condições de preparação do catalisador que garantem reprodutibilidade ao sistema.

O estudo da adição de antioxidantes de comportamento conhecido ao sistema apresentou resultados esperados: o período de supressão da luz se correlaciona com a concentração de antioxidante presente na amostra de forma linear para os aditivos utilizados (trolox, ácido úrico, ácido ascórbico, cisteína, hespiridina e glutationa). Foi desenvolvido ainda um novo método de análise de dados que elimina o erro intrinsico de uma avaliação temporal, representando a capacidade antioxidantes em termo de fótons suprimidos. Este valor é calculado, normalizando-se a curva de emissão através de sua intensidade máxima, em seguida, integrando-se I/Iº em função do tempo de supressão. Os valores obtidos para n_TRAP (número de radicais sequestrado por molécula de antioxidante), utilizando o tempo de supressão, são próximos aos encontrados na literatura² (1,3 para ácido úrico e 0,2 para ácido ascórbico).

Conclusão

Foi desenvolvido um ensaio para a determinação do efeito antioxidante de produtos naturais, misturas complexas e substâncias isoladas. Os resultados indicam a viabilidade da metodologia sendo os valores de TRAP obtidos para antioxidantes conhecidos estão em conformidade com os da literatura.