Estresse oxidativo do DNA: Determinação do indicador biológico 8-hidróxi-2’-deoxiguanosina em urina por HPLC-ECD


Bruno Spinosa De Martinis (PG) e Maria de Lourdes Pires Bianchi (PQ)


Departamento de Análises Clínicas, Toxicológicas e Bromatológicas

Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto

Universidade de São Paulo


Palavras chaves: Estresse oxidativo, 8-hidróxi-2’-deoxiguanosina, HPLC-ECD


Apesar do oxigênio ser essencial à vida, ele pode dar origem a diferentes espécies reativas como parte do metabolismo normal. Essas espécies reativas podem causar vários processos degenerativos como envelhecimento, desenvolvimento de catarata, aparecimento de tumores, doenças do coração ou mesmo a morte.

Existe uma série de mecanismos, para inativar estas espécies reativas. Entretanto, sob determinadas condições, quando os níveis dessas espécies superam a capacidade dos mecanismos de proteção devido a fatores como irradiação, fatores ambientais, metabolismos celulares, substâncias químicas e radiação ionizante, ocorre o ataca de componentes do DNA resultando, frequentemente, em danos oxidativos. Um exemplo desses danos oxidativos é a hidroxilação de bases de DNA.

Um dos mecanismos para a diminuição desses danos e através da reparação do DNA, a qual é realizada in vivo através de enzimas, sendo que os produtos formados são transportados através do sangue e excretados juntamente com a urina. Entre os diversos produtos formados, a base 8-hidróxi-2’-deoxiguanosina (8-OHdG) é a mais comum e presente na urina em maiores concentrações.

O interesse no desenvolvimento de metodologias analíticas para a detecção dos danos causados por estas espécies in vivo é cada vez maior. Metodologias analíticas para a determinação de 8-OHdG em DNA estão bem estabelecidas e descritas na literatura porém, para as análises de rotina desta base como um indicador biológico em monitoramentos terapêuticos e estudos clínicos em fluidos biológicos como urina, plasma e saliva, ainda apresentam problemas e necessitam ser melhor estudadas.

O objetivo deste trabalho foi desenvolver uma metodologia analítica simples, rápida, sensível e adequada às condições do laboratório para a determinação da base 8-OHdG em amostras de urina de ratos.

Para isso, seis ratos machos Wistar pesando entre 180-210g foram colocados individualmente em gaiolas metabólicas. Os animais foram alimentados com água e ração ad libitum, e mantidos a 22oC com ciclos de 12 horas claro/escuro. Durante o período de 24 horas todo o volume de urina foi coletado. As amostras de urina foram armazenadas em freezer -20oC durante um mês até as análises. Essas amostras foram então descongeladas e homogeneizadas e 2,5 mL foram centrifugados durante 10 min/1500g. Em seguida, 2,0 mL do sobrenadante foram misturados com 1,0 mL de solução tampão fosfato 0,1M pH 6,0. As amostras foram centrifugadas novamente por 10 min/1500g e 2,8 mL do sobrenadante foram adicionados em uma coluna de extração em fase sólida previamente condicionada com 10 mL de metanol, 5 mL de água deionizada e 10 mL de uma solução tampão fosfato 0,1M pH 6,0. A coluna de extração foi então lavada com 1 mL de água deionizada e deixada secar sob vácuo durante 10 min. A eluição da base 8-OHdG da coluna foi feita através da adição de 6 mL de uma solução de ácido fosfórico 0,1M. Todo o material eluído foi coletado e analisado por cromatografia em fase líquida de alta eficiência com detecção eletroquímica (HPLC-ECD).

Para a análise por HPLC-ECD, foi utilizada uma coluna de fase reversa de C18 (150mm x 4,1mm) com partículas de 10 mm. 20 mL da amostra foram injetados e eluídos com fase móvel de 12,5 mM ácido cítrico, 25 mM acetato de sódio, 10 mM ácido acético, 30 mM hidróxido de sódio e 10 mg/L EDTA, com fluxo de 0,85 mL/min. A detecção da base 8-OHdG foi feita em potêncial de + 0,6 V.

Resultados obtidos neste trabalho, indicaram que a recuperação da 8-OHdG foi de 74,5%±12% (n=4). Pelos cromatogramas obtidos, pode ser visto que apesar da urina conter vários interferentes, foi possível a quantificação da base em todas as amostras coletadas. O limite de detecção do método, definido como a altura do pico igual a três vezes a razão sinal/ruído do detector é de 5,0 mg/L.

As principais vantagens do método quando comparado com outros descritos na literatura são: não utilização de solventes orgânicos, extração da base da urina em uma única etapa, baixo custo, simplicidade e rapidez.

FAPESP

Principais bibliografias


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