INVESTIGAÇÃO DE PAEPALANTHUS RAMOSUS (ERIOCAULACEAE) POR C30-HPLC-RMN


Lourdes Campaner dos.Santos (PG)1, Fabio Donisete Pezzuto de Andrade (PG)1, Wagner Vilegas (PQ)1, Markus Dachtler(PG)2, Klaus Albert(PQ)2


1- Departamento de Química Orgânica Instituto de Química - UNESP- Cx.Postal 355-Araraquara-SP-Brasil

2- Instituto de Química Orgânica - Universidade de Tubingen -Auf der Morgenstelle 18,D-72076 - Tubingen - Alemanha


Palavras Chaves: C30-HPLC-RMN , flavonóides, Eriocaulaceae.


Introdução: O acoplamento HPLC-RMN fornece novas perspectivas ao trabalho fitoquímico, possibilitando a separação e identificação simultaneamente. As principais vantagens desse acoplamento são a rapidez da análise partindo-se do extrato bruto e a baixa quantidade de material vegetal envolvida na análise [1]. Para reduzir a desvantagem de baixa concentração de substâncias na probe de RMN no momento da detecção, a etapa cromatográfica requer o uso de colunas de alta capacidade e seletividade. Fases poliméricas C30 têm apresentado excepcional seletividade quando comparadas com as fases reversas tradicionais, sendo inclusive, utilizadas na separação de isômeros geométricos [2]. Espécies da família Eriocaulacea têm sido estudadas botanicamente por mais de duas décadas e ainda assim existem controvérsias quanto à posição taxonômica de alguns gêneros [4]. Em trabalhos anteriores apresentamos o isolamento e identificação de flavonóides que possibilitam auxiliar na quimiotaxonomia das espécies auxiliando o trabalho botânico. Uma grande dificuldade no estudo de Eriocaulacea é obter extratos em quantidade suficiente para análises fitoquímicas, já que muitas de suas espécies são de pequeno porte e distribuição dispersa, necessitando coletar uma grande quantidade de indivíduos, alguns em risco de extinção. Neste trabalho relatamos o uso do acoplamento HPLC-RMN utilizando coluna C30 para a separação e identificação de flavonóides existentes nos capítulos de Paepalanthus ramosus (seção Actinocephalus). Os flavonóides isolados e identificados por esta técnica, 6-metoxikaempferol-3-O-b-D-glucopiranosídeo (1) e 6-metoxikaempferol-3-O-b-D-6”(p-cumaroil)glucopiranosideo (2), são considerados importantes marcadores taxonômicos para a seção Actinoceplalus[3].

Experimental: 39 g dos capítulos de P. ramosus foram macerados sucessivamente com 500 mL de hexano, diclorometano, etanol e etanol 70%. 100 mg do extrato etanólico foram dissolvidos em 1 mL de metanol, homogeneizados por 15 minutos em ultra-som e injetados no sistema HPLC-RMN. Utilizamos uma coluna de fase C30 de 250 mm x 4,6 mm (d.i.), com 3 mm de tamanho de partícula da Bischoff, Leonberg, Alemanha. Como fase móvel utilizamos A: Metanol e B: água deuterada. A eluição foi no modo gradiente de 60% a 100% de A, totalizando 45 minutos de análise. O fluxo foi de 1ml/min e a eluição foi monitorada por detector UV-visível a 370 nm. O espectrômetro utilizado para a detecção dos espectros de RMN 1H foi um Buker AMX 600 (600.13 MHz) equipado com uma probe inversa especial para o acoplamento com o sistema de cromatografia de capacidade de 120 mL. O experimento foi realizado com fluxo estático na probe.

Resultados e Discussão: Dois picos foram observados em 14.0 e 19.0 min. A separação cromatográfica foi realizada em menos de 25 minutos mostrando excelente separação e resolução. Foi utilizado fluxo estático para registrar o espectro de RMN 1H. A interpretação do espectro de RMN 1H dos flavonóides 1 e 2 foi realizada considerando-se o deslocamento químico e as constantes de acoplamento e comparação com dados da literatura [3]. As pequenas variações observadas nos deslocamentos químicos em relação aos dados da literatura referem-se à utilização de solventes deuterados diferentes. A análise por fluxo estático é mais demorada do que a por fluxo continuo. No entanto, apresenta várias vantagens: a pré-saturação do sinal do solvente, que reduz o sinal do solvente; um melhor ajuste da probe e a otimização do número de transientes para cada pico detectado.

Conclusão: O uso do acoplamento HPLC-RMN possibilitou uma eficiente separação e identificação das substâncias majoritárias de P. ramosus, a partir de pequena quantidade de extrato e solventes, fácil “clean-up” e um curto tempo de análise. As condições cromatográficas com as colunas C30 ofereceram excelente resolução e foi possível a separação de dois importantes flavonóides, usados como marcadores taxonômicos. Este trabalho mostra que a utilização de técnicas hifenizadas é uma importante ferramenta para resolver problemas taxonômicos.

Referências Bibliográficas:

1-Albert, K. 1995. J. Chromatography A, 703, 123-147.

2-Dachtler, M., Kohler, K. and Albert, K. 1998 J. Chromatography B, 720, 211-216.

3-Andrade, F.D.P., Santos, L.C., Dokkedal, A.L., Vilegas, W. 1999. Phytochemistry, 51, 411-415.

4-Giulietti, A.M., Amaral, M.C.E., Bitrich, V. 1995 Kew Bull., 50, 55-60. Biol.Abstr. 100(9), 129831 UD 9504.












(1)

(2)








FAPESP-CNPq