ESTUDO DA ATIVIDADE DE CUMARINAS NO METABOLISMO OXIDATIVO DE NEUTRÓFILOS
Luciana Mariko Kabeya (IC); Ana Elisa Calleiro Seixas Azollini (PQ);
Frederico Marianetti Soriani (IC); João Luis Callegari Lopes (PQ);
Yara Maria Lucisano Valim (PQ).
Departamento de Física e Química, Faculdade de Ciências Farmacêuticas
de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo
Palavras-chave: cumarinas, radicais de oxigênio, neutrófilos
As Cumarinas constituem uma classe de metabólitos secundários derivados do ácido cinâmico, amplamente distribuídos no reino vegetal, podendo também ser encontrados em fungos e bactérias. A esses compostos atribui-se uma grande variedade de atividades biológicas, como a antimicrobiana, antiviral, antiinflamatória, antiespasmódica, antitumoral e antioxidante, as quais podem estar relacionadas com a inibição da atividade de enzimas, por exemplo, daquelas envolvidas no metabolismo do ácido araquidônico, e com a sua atividade “scavenger” de espécies reativas de oxigênio (ROS).
No organismo, as ROS podem ser geradas em processos metabólicos normais, devido a estímulos ambientais ou por células fagocíticas durante uma infecção. Estas células (neutrófilos e fagócitos mononucleares) sofrem uma alteração metabólica imediata, denominada “burst” respiratório, quando expostas a alguns estímulos, como partículas antigênicas opsonizadas com componentes do sistema complemento. As ROS são produzidas seqüencialmente, iniciando-se com a produção de radicais superóxido (O2-.) pela ativação da enzima NADPH oxidase ligada à membrana das células fagocíticas. Estas ROS estão envolvidas na morte de microrganismos invasores, como bactérias e leveduras, e de células tumorais.
Apesar desses benefícios, as ROS também estão envolvidas na patogênese de diversas desordens, como câncer e aterosclerose. Vários estudos tem sido realizados para o entendimento do mecanismo de ação dessas drogas, o que pode levar ao desenvolvimento de medicamentos para o tratamento e profilaxia de doenças, além de ser útil na indústria alimentícia e cosmética.
O processo fagocítico é acompanhado da produção de luz, fenômeno conhecido como Quimioluminescência (QL). A intensidade da QL é tipicamente muito baixa, mas pode ser aumentada significativamente na presença de algumas substâncias luminescentes, como Luminol e Lucigenina. O primeiro é eficiente em sistemas onde radicais livres de oxigênio e/ou radicais lipídicos são produzidos, enquanto a segunda é específica para radicais superóxido.
Neste trabalho realizou-se o estudo do efeito da Cumarina (1,2-benzopirona) e de três de suas derivadas (7-Hidroxicumarina, 7-Acetoxicumarina e 7-Aliloxicumarina) sobre o metabolismo oxidativo de neutrófilos de coelho estimulados, a fim de obter curvas dose-resposta e informações para a discussão da relação entre a estrutura química e a atividade biológica desses compostos.
Para estimular os neutrófilos no processo fagocítico empregou-se o Zimosan opsonizado com soro normal de coelho. O Zimosan é uma preparação de células de levedura (Saccharomyces cerevisiae) que, em contato com o soro sangüíneo, ativa o sistema complemento, produzindo partículas revestidas (opsonizadas) com componentes do mesmo (C3b, C3bi). Estes, por sua vez, são reconhecidos por receptores de membrana dos neutrófilos, levando ao processo de fagocitose.
As drogas foram obtidas de fontes sintéticas e comerciais, sendo purificadas por recristalização em água e submetidas a análises por cromatografia gasosa e espectrometria de ressonância magnética nuclear de prótons (H1- NMR). Esses procedimentos asseguraram uma pureza de 96 a 100 % dos compostos testados.
Para verificar o efeito das drogas sobre a produção dos diversos radicais gerados no processo fagocítico incuba-se uma suspensão 2. 10 6 células em solução de Hank’s pH 7,2 em banho-maria a 37 ºC por 3 minutos. Adicionam-se 2 mg de Zimosan opsonizado, 10-4 M de Luminol e 10 mL das drogas, obtendo um volume final de 2 mL. As cumarinas, dissolvidas em DMSO, foram utilizadas de modo a obter concentrações finais de 200, 100, 50, 25 e 12.5 mM. Realiza-se a leitura da QL (em milivolts) em intervalos de 10 segundos por 10 minutos, a 37 ºC, em luminômetro Bio-Orbit modelo 1250, obtendo-se uma curva de QL versus tempo. Calcula-se a área integrada de QL de 0 a 10 minutos, sendo este valor empregado na determinação da porcentagem de inibição ou estimulação produzida em cada concentração, em relação ao controle.
Para o estudo da ação das drogas sobre a produção de radicais O2-. segue-se o mesmo procedimento, substituindo-se o Luminol por 10-4 M de Lucigenina.
Observou-se que a Cumarina não afeta a produção de radicais O2-., enquanto suas derivadas apresentaram efeito inibitório dose-dependente. Nas concentrações mais elevadas, 200 e 100 mM, a 7-Hidroxicumarina e a 7-Acetoxicumarina produziram efeitos semelhantes, e o efeito da 7-Aliloxicumarina foi menor. Nas demais concentrações, a ordem decrescente de inibição foi 7-Acetoxicumarina > 7-Hidroxicumarina > 7-Aliloxicumarina.
Nos ensaios de QL dependente de Luminol verificou-se que a 7-Hidroxicumarina apresentou efeito estimulatório sobre a produção das diversas ROS, enquanto as outras drogas não produziram efeito no sistema em questão.
Os resultados obtidos sugerem que a presença de substituintes na posição 7 do anel de benzopirona são importantes para a atividade inibitória da produção de radicais O2-.. Entretanto, este substituinte não pode ser fenólico, pois pode levar à formação de novos radicais, atuando como pró-oxidante.
HOULT, J.R.S.; PAYÁ, M. General Pharmacology. 27 (4), 713-22, 1996.
PAYÁ, M. Biochemical Pharmacology. 48 (3), 445-51, 1994.
RUSSO, E.M.S. Dissertação (mestrado). FMRP-USP. 1998
VAN DYKE, K.; . Cellular chemiluminescence. v.1.Boca Raton, CRC Press, 1987.
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