ESTUDO DA LIGAÇÃO DE METAIS À PROTEÍNAS DO SORO E SUA LIBERAÇÃO POR AÇÃO DE MICROONDAS PARA A DETERMINAÇÃO POR ESPECTROMETRIA DE ABSORÇÃO ATÔMICA

Denise Bohrer (PQ)¹, Solange Pomblum (PQ)², Paulo Cícero do Nascimento (PQ)¹, Josiane Bastianello (IC)² e Adrian Ramirez (IC)¹

¹ Departamento de Química, ² Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, Universidade Federal de Santa Maria, RS

palavras-chave: desproteinização, EAA, cobre, zinco, níquel, manganês

A determinação de metais no sangue pode ser utilizada não apenas para verificar as condições gerais de pacientes ou determinar o seu grau de intoxicação, mas também na avaliação de exposição ambiental e no diagnóstico de doenças, como o cobre no caso da doença de Wilson.

A espectrometria de absorção atômica (EAA) é uma das técnicas mais empregadas na determinação de metais mas, para a análise de sangue, seja por chama ou forno de grafite, uma redução do teor de proteínas é necessária para evitar uma elevada radiação de fundo, aspiração de amostras muito viscosas e formação de resíduos carbonáceos no forno de grafite. Dentre as técnicas de desproteinização, a precipitação por ação de ácidos, sais ou solventes, é a mais empregada, podendo ocorrer por desnaturação das proteínas ou redução de sua solubilidade [1].

Como metais são transportados no sangue através das proteínas, há geralmente uma proteína ou grupo delas às quais eles se ligam. Mesmo metais não não essenciais ligam-se à proteínas. Desta forma, técnicas de desproteinização para a determinação de metais, só serão eficientes se promoverem a liberação do metal antes da precipitação, e portanto, ensaios de recuperação devem mostrar que o metal adicionado se ligou às proteínas e foi liberado.

Neste trabalho quatro metais foram utilizados em testes de incubação do soro para verificar sua ligação às proteínas e posterior liberação por desproteinização. Cobre e zinco que são essenciais e existem em concentrações relativamente elevadas no sangue e níquel e manganês, também essenciais, mas presentes em concentrações muito baixas. Cu e Zn são geralmente determinados por EAA com chama, e Ni e Mn com forno de grafite.

As amostras de soro foram submetidas a um processo de incubação para que o metal adicionado se ligasse às proteínas do mesmo modo como ocorre no organismo. Às amostras foram adicionados individualmente 500 mg/L de Cu e Zn, 100 mg/L de Ni e 40 mg/L de Mn, e estas foram incubadas a 37°C por até 96 h. Em intervalos de tempo de 24 h, alíquotas de soro foram retiradas do banho termostático, ultrafiltradas em membranas de 20 000 Da e o ultrafiltrado analisado em relação a cada metal por EAA em forno de grafite. Os 4 metais se comportaram de forma diferente em relação ao tempo de incubação. Enquanto para Cu e Zn 24 h foram suficientes para que praticamente todo o metal adicionado se ligasse às proteínas, para Ni e Mn foram necessárias 72 h. Esses tempos de incubação foram adotados para preparar o soro para os ensaios de desproteinização.

A radiação por microondas em meio levemente acidificado foi utilizada para promover uma precipitação gradual das proteínas. Para isto, foi preparado um “pool” de soro e a 4 porções individuais, cada um dos metais foi adicionado, na concentração já citada, e o procedimento de incubação executado, nos intervalos de tempo estabelecidos. Para a desproteinização, 1 mL de soro foi misturado a 1 mL de solução 1% (m/v) de ácido tricloroacético (TCA), e submetido a um programa no forno de microondas (doméstico) com um aumento gradativo da potência, até a potência máxima, por um tempo total de 10 min. Após o procedimento as amostras foram analisadas com o teste de Coomassie para verificar o teor residual de proteínas, e os metais analisados no sobrenadante. Ni e Mn diretamente, no forno de grafite e Cu e Zn, após diluição 1+9, na chama. Os mesmos ensaios foram realizados com amostras desproteinizadas pela ação de uma solução mais concentrada de TCA, 10%, sem microondas. Como controle, amostras do “pool” de soro, antes e após a adição dos metais e incubação, foram analisadas diretamente por EAA, Cu e Zn após diluição 1+9, e Ni e Mn 1+1 com água. Os valores encontrados serviram como “branco” para os ensaios de recuperação.

Os resultados mostraram que a desproteinização por ação de microondas- TCA 1% é tão eficiente quanto a ação do ácido na concentração usual, 10%; os residuais de proteínas nos sobrenadantes foram de 12,5 ± 3,4 mg/L e 10,6 ± 2,7 mg/L respectivamente. A recuperação dos metais ficou entre 90 e 100% para as amostras submetidas às microondas e entre 50 e 70% para àquelas desproteini-zadas com TCA 10%.

Como a viscosidade da amostra é um fator importante na EAA, ensaios de viscosidade foram realizados com soro puro, apenas diluido 1+0,87 e desproteinizado. Ao adicionar o agente desproteinizante a amostra sofre uma diluição de acordo com o volume adicionado, mas a diluição final da amostra não é dada pela soma dos dois volumes, pois devido ao deslocamento das proteínas, o volume do soro (sobrenadante) sofre uma redução de até 13% [2]. Desta forma, para simular o volume do sobrenadante após a desproteinização, o soro foi diluído em 1+0,87 com água. Os resultados mostraram que o soro puro e o soro apenas diluído são respectivamente 45% e 22% mais viscosos do que o desproteinizado

Este trabalho mostrou que como os metais se encontram ligados às proteínas, uma desproteinização muito rápida pode levar a perdas do analito porque este não se desligou das proteínas e coprecipitou ou ficou ocluso no precipitado. A incubação da amostra a 37°C, promoveu a ligação dos metais às proteínas e foi importante nos ensaios de recuperação da técnica de desproteinização, que devem mostrar se são efetivas para promover a liberação do metal. A desproteinização por ação de microondas promove uma desproteinização gradual com simultânea liberação dos metais. A desproteinização reduz a viscosidade do soro, o que torna a amostra mais semelhante a padrões aquosos e reduz problemas de pipetagem e aspiração nas medidas por EAA.

1. McDowall, R.D., J. Chromatogr. 492, 3-53, 1989

2. Fielding, J., Ryall, R. G., Clin. Chim. Acta 33, 235-240, 1971

[CNPq]